学术分享

我们非常重视您的个人隐私,当您访问我们的网站时,请同意使用所有的cookie。如果您想详细的了解我们如何使用cookie,请访问我们的 隐私政策.

【干货分享】第四期:PCR结果分析,自动基线也别用啦

基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即所谓的基线(如图1)。

2022-02-21


上期干货分享,淘气的小编留了一手,其实调节阈值线在ABI7500上还有更快捷的方法,只要在曲线图下方把“Auto”取消,再点击勾选Show:Threshold就可以啦!(如下图所示)

细心的你可能发现,除了Threshold(阈值线),还有Auto Baseline(自动基线)。在通常情况下,PCR实验结束,阈值线和基线都是默认为“Auto”的,今天,我们就来聊一聊什么是基线?取消自动基线,如何调节基线范围?以及,基线调节和阈值线调节是怎样配合分析PCR结果的?
 1. 什么是基线? 

基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即所谓的基线(如图1)。
基线范围的设置是同步设置的,即不管一个实验数据里面有多少扩增曲线和通道,以及各曲线指数增长期的起始位置,以ABI7500为例,该仪器一般默认的起始和终止循环数为3~15个循环(如图2)
图 1

图 2



2. 仪器自动基线与手动基线会呈现怎样不同的结果?

情况一:你是否也遇到过这样扩增曲线,如图3所示,器自动基线设置的太宽,就会导致基线下倾的现象。

图 3

导致这种现象的主要原因就是机器自动基线设置的太宽导致的,标本在15个循环之前就进入指数增长期,而机器自动基线固定的把指数增长期作为基线,就导致此种曲线的出现,只需手动把基线起始循环数调整为指数增长期之前即可,比如将此数据的起止循环数调整为3-8个循环数后,扩增曲线就恢复正常了,如图4所示:

图 4


情况二:基线不平,不仅可能存在的弱阳性曲线“被淹没”,还导致阈值线“无从安放”,如图5所示:

图 5

此时,只需手动把基线的起止循环数调整到合适位置即可,比如,把图5的起止循环数改为10-20个循环后,基线就会变平整,阈值线也不再“无从安放”,如图6所示:

图 6


情况三:实验中常见的气泡干扰实验结果分析,如图7所示:

图 7

气泡导致的折线,不仅影响阈值线调节的准确性,更会影响结果的判读。这种情况怎么调整基线呢?很简单,只需把基线的起始循环数设置在气泡出现的循环数后即可。比如,图7中的2个孔位气泡破裂的循环数为11、14,我们将起止循环数设置为15-20后,即可恢复正常,如图8所示:

图 8

此时调节阈值线,会更容易判断阈值线应该处于什么位置(可以参考上一篇干货——调节阈值线),从而得到更准确的Ct值。



3. 如何手动调节基线?

文章开头介绍了在ABI7500上调节手动基线的快捷方法;而根据仪器的区别,调节基线的方式也会有所区别。一般来说,调节基线的位置都会在“Analysis”→ “Analysis Settings”这样的菜单栏选项中,取消所有的“Auto…”,输入合适的基线范围,再“Apply”即可。不知道多少合适?没关系,多调试几个基线的范围就可以调整出既美观又准确的基线了。


开云官方(中国)官方网站医疗

上海伯杰医疗科技有限公司是一家致力于感染性病原体分子诊断试剂研发和应用,深耕于多重荧光 PCR 诊断试剂和痕量病毒二代测序试剂及相关服务的国家高新技术企业。公司围绕感染性病原体这一主线,从诊断试剂、诊断仪器、测序服务和医检所服务等多个面提供全套解决方案。公司秉承“勇于创新,质量为先”的方针,为医疗机构、疾控公卫、高校科研等合作伙伴提供优质产品与服务。

全国客服电话:400-860-3688