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【干货分享】第六期:探秘核酸提取

2022-02-21

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前言

近日,国家药监局正式发布行业标准《核酸提取试剂盒(磁珠法)》YY/T 1717-2020。此标准对核酸提取试剂盒(磁珠法)的分类、技术要求、试验方法等进行了相关规范,填补了该领域标准空白,对于分子诊断行业产品的长远发展、以及现阶段新冠疫情防控有着重要意义。


在分子诊断领域,核酸提取是实验中最基本、最重要的环节,关系着分子实验的成败。磁珠法只是核酸提取方法之一,下面就让我们来了解一下核酸提取的原理和各种方法吧~





核酸抽提原理

简单来说,核酸抽提包含裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与裂解体系中的其他成分,如蛋白质、多糖、脂质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、Tween20等)和盐(Tris、EDTA等)。去污剂是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用,则是出了提供一个合适的裂解环境,还包括抑制样本中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏、维持核酸结构的稳定等。裂解体系中还有可能加入蛋白酶,促进核酸与蛋白质分开。

常用的纯化方法,一是醇沉淀,使用醇将核酸沉淀下来,实现核酸与盐的分离。二是介质纯化,在某些特定的条件下,特殊的固相介质可选择性地吸附核酸,而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及其它杂质的分离。第三,也有不纯化的抽提方法,多用于快速提取。其它杂质如多糖、多酚,基本上都是在这两种方法的基础上,通过增加一些特别的试剂,或者增加一些额外的步骤来实现的。




核酸提取方法

01

酚氯仿法

苯酚和氯仿均为有机溶剂,其萃取核酸原理是苯酚与氯仿对于与核酸结合的蛋白质有极强的变性作用,但对核酸本身没有影响。经离心后,形成上层水相下层酚/氯仿相,变性后的蛋白质溶于酚/氯仿相或者在两相交界处形成凝胶层,而核酸易溶于水而不溶于有机溶剂从而留在水相;同时,氯仿可以有助于有机相与水相的分离和去除溶于水的部分酚。最后,再将核酸通过乙醇沉淀即可达到提取的目的。

此法的缺点是:


蛋白质难以彻底去除;


操作难度大且费时;


使用危险化学品。


02

热裂解法

样本中加入促细胞裂解的化学物质(SDS、Tween 20等),可加入蛋白酶K消化一段时间,也可不加,95℃以上加热10分钟左右;高速离心,上清中的DNA即可用于PCR扩增。该方法操作简便,成本低,一般仅用于血清或体液中病原体核酸的提取。

此方法在临床应用广泛,但缺点是:


核酸纯度低,产量低;


提取出的核酸除了PCR外不能直接用于其它分子生物学操作。


03

膜过滤柱法

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜,在高盐环境下,这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上,而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。最后通过洗脱,将核酸从吸附膜上脱离,即可得到纯化后的核酸。这也是试剂盒提取中广泛使用的方法。




但即便如此,该方法仍存在缺点:


高度依赖吸附膜的结合能力;


洗脱不完全导致核酸流失;


无法大量提取核酸,较难实现自动化。


04

磁分离法

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸,主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA(例如从血液样本中检测HIV 或HBV 病毒基因组的样品制备)。一般而言,将样品与结合缓冲液和磁珠混合,核酸与磁珠结合后,经过数次洗涤与磁场捕获,洗脱下来的核酸即可通过PCR或其它特定方法来检测特定的DNA或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业,且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。




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