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【干货分享】第二期：颜色补偿那些事儿

2022-01-20

多重荧光PCR已经广泛地使用在各种病原体的检测中，这得益于荧光PCR检测仪多通道荧光采集的功能。在使用罗氏480（LC1/LC2/Z cobas)进行多重检测时，往往会遇到需要做颜色补偿的情况，那么今天小编就与您聊一聊关于颜色补偿的那些事儿~

为什么罗氏480需要做颜色补偿？

首先，我们来看一下罗氏480的激发波长及检测波长

LightCycler1的滤光片:

图片.png

LightCycler2的滤光片:

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荧光通道发射光谱抛物线示意图：

图片.png

从上图可以看出在一个多色反应中，由于各染料的发射光的波长有重叠，导致一个通道能够捕获到另一个通道所检测的染料信号。这种荧光信号的溢出会导致无效的数据产生，即我们常说的“串色”或“串孔”现象。

由于每台仪器的滤光片是固定的，无法改变其激发光与检测光波长；想要校正这种溢出，在运行这个实验或分析这个数据时，就需要应用颜色补偿目标。当用颜色补偿目标时，LightCycler 算法会使用补偿实验文件中的数据来补偿荧光值的溢出，补偿后即可以看到每个通道特定的信号。

什么时候要做颜色补偿？

只有当多个荧光通道（比如VIC和ROX同时使用）用于数据分析时才有必要采用颜色补偿，当使用单通道时无需采用颜色补偿。

另外，由于合成的探针的荧光染料各个厂家之间存在一定的差异性，因此，不同厂家之间的颜色补偿数据一般不通用。在更换检测试剂盒时，需要进行对应厂家试剂的颜色补偿实验哦~

如何使用颜色补偿？

首先，按颜色补偿说明书进行颜色补偿实验

其次，进行常规的检测实验

最后，在每次检测完毕的分析界面调用补偿数据，具体操作如下：

A. 点击Color Comp 旁下拉菜单

图片.png

B. 选择In Database

图片.png

C. 选择补偿实验数据

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D. 最后重新计算即可

E. 补偿前后结果对比：

图片.png

补偿前

图片.png

补偿后

从补偿前后结果来看，即可确定VIC通道中的翘尾，是ROX通道串孔所致。罗氏480分析界面调用补偿文件的方法也是一键操作，十分简便。针对一个厂家的试剂，颜色补偿实验只需做一次，数据便可一直使用。