学术分享

从1987年首次发现CRISPR, 到最近几年CRISPR-associated(Cas)技术的广泛应用，以及2020年的诺贝尔化学奖颁给了CRISPR的发现者，CRISPR技术被誉为会改变和造福人类的发明。短短几年时间，CRISPR技术成为科研界的热门内容，被称为下一代分子诊断技术！

在专题讲座《速度为先 | 新冠核酸快速检测技术的应用及展望》中，胡必杰教授提出对于现在新型冠状病毒，国家提到了快速检测，上海市自10月28日起，全市首批21家二级以上综合性医疗机构面向市民提供24小时核酸检测服务，争取6小时出报告，对于现在新冠快速核酸检测技术，与赵院士一起探讨了值得期待和进一步开发的技术和应用。

赵国屏院士以新冠为例，讲到对于一个“好的”临床检验产品，有5个关键要求：

第一，就是要正确，不能“错怪好人”，不能出现“假阳性；必须准确，不能“张冠李戴”，专一性、特异性要好。第二一定要灵敏，也就是说不能“放过坏人”，不能出现假阴性。第三最好能够“定量”。定量是确定检测结果准确与否的重要佐证。第四，要快速，简便；第五成本要尽可能低。

胡必杰教授表示，赵院士提到的“不抓错好人”、“不放过坏人”，同时定量，让临床医生更加精准地去辨别是感染的病原体还是污染的病原体，同时简捷方便与价优，是非常重要的。如果一项分子诊断技术非常昂贵，很多病人享受不到，只有达到以上五点要求，这项技术才能广泛应用到临床，最终让老百姓和普通病人得益。

等温扩增与CRISPR诊断技术

的有机结合

而后赵院士提到，在过去几十年的时间里，等温扩增技术得到了极大的发展，现有也已经开发了很多种方法体系，包括经典LAMP技术和RPA技术。等温扩增有快速灵敏，对仪器要求低，是分子POCT诊断领域重要的技术力量。

第二项技术即是最近发展的CRISPR诊断技术。主流CRISPR诊断技术主要基于CRISPR-Cas12或Cas13来开发，利用了Cas蛋白“反式切割活性”，可以将体系中的单链核酸高效的切割。

所以，CRISPR诊断的原理就是：当待检体系中存在靶标核酸时，Cas蛋白在向导RNA的引导下特异识别靶标序列，形成复合物，进而被激发出针对切割单链核酸的“反式切割活性“，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成检测过程，通过检测体系是否发光来判断靶标核酸是否存在。

将恒温扩增和CRISPR诊断技术结合起来，既可以利用恒温扩增的快，灵敏和简便，又可以利用CRISPR的特异和灵敏，在进行快检的同时，既不用担心检测的假阳性和假阴性问题，也不用担心PCR检测中不确定的“灰区”问题。

对于伯杰利用由其实验室开发的，吐露港公司授权的CRISPR诊断专利技术，成功开发的国内首款CRISPR快检一体机BG-Nova-X8，院士对其速度和通量表示了赞赏，认为仪器可以在30-40分钟内完成24个新冠标本检测，可以期待这个系统能够为新冠快检多做贡献。

赵院士提到，未来技术的展望，等温扩增的特异性和灵敏度都需要进一步提升，可以通过和别的技术结合，“取长补短”来提升检测特异性和灵敏度，这一次伯杰将等温扩增与CRISPR技术的尝试，就是迈出了可喜的一步。

等温扩增的一管多重问题还需要创新的思路或者原理方面的突破，另一方面把恒温扩增，CRISPR诊断技术，和数字PCR技术的绝对定量原理结合起来，来实现绝对定量，在未来有更多发展的可能性。 

可以说，CRISPR/Cas系统毫无疑问为感染性疾病的诊断提供了新的方法和契机，总结来说，它具有如下优点：

这几大优点使得CRISPR检测平台可以对病原体核酸分子实现实时快速检测。根据以上的分析，未来CRISPR技术的两大研究方向也初见雏形：

第一，是新的Cas蛋白的开发及突变体的筛选鉴定。例如后来发现的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅长识别单链DNA，丰富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的筛选鉴定为提高检测通量及降低“脱靶效应”提供了方法。

第二，是将CRISPR/Cas其和其他的技术平台结合起来，开发新颖实用的生物传感策略。比如将Cas9蛋白固定于石墨烯场效应晶体管，以及将Cas系统的报告探针固定于电极上，从而实现不需要使用信号扩增的电化学生物传感器的构建。使用水凝胶作为其响应原件实现多样化的信号输出。与微流体技术结合开发出的CARMAN技术，可以对数十个样本，上百种病毒进行快速检测，为解决通量低的问题提供了方法等。

不断地将新兴的材料与技术与CRISPR技术结合实现优势互补，开发出更实用新颖的检测策略用于感染性疾病诊断，将是未来一段时间内的研究重点。